摘要

局部进展期直肠癌（LARC）术前接受新辅助放化疗（NCRT）可以降低局部复发率，且对新辅助放化疗有应答的患者预后普遍较好，遗憾的是当前阶段的新辅助放化疗并不能为所有患者带来获益，为避免部分患者接受治疗后无应答且还会出现NCRT副作用而成为“无效-有害”人群，临床阶段一直在探寻更好的分子标志物以提早筛选出更大概率获益或接受新辅助治疗后仍预后不良的的局部进展期直肠癌患者，而针对不同的患者群体实施更具个性化的治疗方案。本研究通过分析NCRT治疗前后LARC患者外周血中ctDNA水平的变化，并将其与临床疗效及预后相关联，结果表明治疗前ctDNA阳性的患者术后无病生存及总生存分别降低1.47年和1.41年（p(DFS) = 0.015，p(OS) = 0.010），提示患者接受新辅助治疗前的基线ctDNA的检出是患者总生存的预后不良标志物；NCRT第1周结束时ctDNA显著减少或完全消除尚不能很好地预测NCRT疗效，本研究提示，新辅助治疗前的局部进展期直肠癌ctDNA检测，对其预后及复发有着非常重要的指导作用，并可以很好的筛查到临床低危患者群体，而对高危患者群体提供更有针对性的治疗策略。

研究背景

LARC，即II期和III期患者，术前应行NCRT，虽然NCRT并不提高总生存（OS），但可将直肠癌局部复发降至10%以下，且NCRT有应答者预后更好。NCRT治疗后15-30%病例获得完全缓解，20-25%病例获得部分缓解，其它患者NCRT后的改变不显著。NCRT有多种副作用，最严重的是放疗后骨盆损伤所致纤维化，可导致肛门括约肌受损发生尿失禁和勃起障碍，还可致其它术后并发症和功能障碍。因此，筛选能从NCRT治疗中获益的疗效预测标志物具有重要的临床意义，可使对NCRT无应答的患者避免承受严重的不良反应。

血中游离DNA（cfDNA）作为潜在的新型分子标志物，在感染、炎症和癌症时可显著升高。血中ctDNA只占cfDNA一小部分，通常包含肿瘤特有的体突变，因此ctDNA成为癌症特异性突变检测的替代来源，而且ctDNA水平与肿瘤负荷相关。目前普遍认为，对放疗有应答的肿瘤，细胞损伤坏死后DNA迅速释放入血，致血中ctDNA水平在被移除之前有一过性升高，鉴于此ctDNA有望作为NCRT治疗。

研究方法

研究队列纳入36例NCRT治疗后手术治疗的LARC患者。治疗前内镜检查获取的组织活检标本用于检测体突变。治疗前和治疗第1周结束时检测血ctDNA突变情况。为了优化液体活检成本，研究中使用了两种方法，先使用低成本的变性毛细管电泳检测，然后对阴性样品使用高灵敏度的BEAMING分析检测。ctDNA与肿瘤退缩程度（TRG）、TNM分期等临床参数进行关联分析。

研究结果

36例患者中有33例（91.7%）检测到体突变，7例患者（7/33，21.2%）治疗前存在ctDNA。治疗前ctDNA阳性的患者其术后无病生存及OS分别为缩短1.47年和1.41年（t(DFS) = 2.95，df(DFS) = 9.88,p(DFS) = 0.015；t(OS) = 3.15,df(OS) = 10.31, p(OS) = 0.010）（图1）。所有患者在NCRT第1周结束时ctDNA均显著减少或从血浆中完全消除（图2），与其他参数均并无相关性。

图1 LARC患者治疗前ctDNA阳性对无病生存(A)和OS (B) 的作用

图2 NCRT第1周的ctDNA动态变化

讨论

本研究拟通过监测接受NCRT治疗的LARC患者的早期血液ctDNA变化用于NCRT疗效预测。既往有很多研究都报道了cfDNA和ctDNA与直肠肿瘤NCRT治疗反应间的关系，但结论并不统一：Zitt等人的研究中评估了LARC治疗前后的cfDNA水平，NCRT无应答和有应答者的cfDNA水平并无显著差异，几乎所有患者的cfDNA水平在NCRT结束时显著下降；Agostini等人的研究结果与Zitt的一致，未观察到治疗前cfDNA水平与NCRT反应间的相关性，但NCRT有反应者的DNA完整性指数明显低于无反应者；Sun等证实结直肠癌患者的cfDNA水平明显高于健康人群，NCRT结束时有应答者的400bp片段浓度明显降低；Carpinetti等对4例患者的肿瘤DNA行全基因组测序，并确定了每个患者的特定DNA片段，有良好应答者NCRT期间ctDNA水平下降，ctDNA升高与癌症进展相关，并先于CEA上升和影像学复发；Li等根据直肠癌患者NCRT前ctDNA阳性预测的治疗反应率为70%，但Yang等人在Li的研究基础上，扩大样本进行研究，并没有证实治疗前ctDNA水平与NCRT应答间的关系。

这项研究假设血浆ctDNA早期变化即可反映NCRT的即时效应，因此可用来预测NCRT的治疗疗效，并期望通过对ctDNA动态评估来区分NCRT治疗无应达者，使无应答者免于更多的治疗副作用，同时有机会接受更加有效的治疗策略。研究先采用了二种检测方法，1级检测显示5例患者ctDNA阳性（5/30，16.7%），2级检测又发现2例患者ctDNA阳性（2/ 4，50%），总阳性率23.3%（7/30），与既往研究结果相似。

与预期相反，研究未观察到ctDNA基线水平与TRG或TNM的相关性。但预后评估显示，基线ctDNA阳性患者无进展生存和OS较短，与Tie等人的研究结果一致，该报道显示ctDNA是OS的不良预后因素，多数ctDNA阳性患者后续影像检查证实存在未被发现的微转移灶。因此，ctDNA阳性可作为指导术后治疗的依据。

所有患者在NCRT第1周结束时ctDNA都显著减少或完全消除，ctDNA水平的降低与最终临床结果无关。显然，治疗后ctDNA快速清除是普遍现象，与患者特征或肿瘤生物学无关。血浆ctDNA去除主要源于酶消化，最近有报道称，放射损伤时，一些在DNA修复中活跃的DNA外切酶释放，推测这种外切酶可致ctDNA清除。为了阐明上述现象，ctDNA监测间隔应进一步缩短，然多数研究都在第7天或之后进行初次采样，因此在治疗开始后的更短时间内检测可能更有必要。最近还有研究采用尿液ctDNA监测非小细胞肺癌靶向治疗反应，检测时间在第1次放化疗后数小时及后续几天，了解ctDNA释放和清除的详细时间对LARC患者NCRT治疗时通过ctDNA预测治疗结果至关重要。

点评

本研究发现LARC患者NCRT治疗前ctDNA的检出与较差的无病生存及总生存相关。NCRT第1周所有患者的ctDNA水平均明显降低，但与TRG或TNM并无直接关联，因此目前不能根据ctDNA水平预测NCRT治疗反应。虽然这些结果可能排除了早期ctDNA变化作为NCRT治疗疗效的预测标志物，但却肯定了基线ctDNA阳性对于患者预后的影响，基线ctDNA阳性患者术后应进行主动的、密切的监测和随访及更具个性化的辅助化疗方案，一旦发现“肿瘤再生长”，应给予积极挽救性干预，争取延长患者生存并保证生活质量，同时该研究也为放化疗所致细胞损伤时ctDNA释放和清除机制的研究开辟了新方向。

参考文献：

Monitoring of Early Changes of Circulating Tumor DNA in the Plasma of Rectal Cancer Patients Receiving Neoadjuvant Concomitant Chemoradiotherapy: Evaluation for Prognosis and Prediction of Therapeutic Response. Front Oncol. 2020 Jul 24;10:1028.

ChosenOne599®基于ctDNA样本的最低检测下限达到0.1%（总测序深度达到30000x），可以一次性检测599个基因的点突变（SNV）、插入缺失（InDel）、基因融合（Fusion）和基因拷贝数变异（CNV），同时评估肿瘤突变负荷（bTMB）和微卫星不稳定（bMSI）。这种大范围、高灵敏的动态监测，进一步提高了ctDNA阴/阳性判定的准确性，为包括结直肠癌在内的多种肿瘤患者的术后复发和总生存预测提供可靠依据。