臻知识·专家访谈 | 第21期
既往研究证实术后或CRT后ctDNA清除的非小细胞肺癌（NSCLC）患者其预后显著获益，但是这些研究所使用的基因检测Panel均需先进行肿瘤组织测序。基于商业化的NGS小Panel ctDNA检测在局部晚期NSCLC复发预测中有怎样的表现呢？求臻医学特邀北京大学肿瘤医院放疗科的肖绍文教授，结合近期发表在Frontiers in Oncology杂志上的文章进行解读。
肖绍文教授：我们都知道，85%的肺癌患者为非小细胞肺癌（NSCLC），其中大约有27%的NSCLC患者诊断时即为局部晚期（LA-NSCLC），这部分患者并没有手术机会，需要进行同步放化疗（CRT），但是，有相当比例的局部晚期患者经标准CRT甚至在CRT后接受免疫巩固治疗后仍会出现复发或远处转移，此外，部分患者单纯通过CRT治疗即可达到治愈无需后续免疫巩固治疗。因此CRT后的治疗疗效，目前尚缺乏有效的预后或预测标志物。
既往虽有研究提示ctDNA可在预测早期以及局部晚期患者的预后中发挥重要作用，但是均需要基线的肿瘤组织样本信息，忽略基线组织的特异突变信息，单纯应用定制化的NGS小Panel进行ctDNA动态监测是否仍具预测价值未知。
本研究一共纳入了43例Ⅱ-Ⅲ期不适合手术的局部晚期NSCLC患者，所有患者均接受了根治性同步放化疗，分别在CRT开始2周前（pre-CRT）、CRT完成后（post-CRT1）、CRT完成后每三月随访直至满12月（post-CRT 2、3、4、5）及肿瘤进展时取血做ctDNA检测。排除掉CRT前ctDNA为阴性、CRT后无法获取血液标本以及非癌症相关死亡的患者，最终共分析17例患者，CRT后第一次ctDNA检测结果为阴性定义为ctDNA清除。结果显示3例患者ctDNA未清除，且均发生复发，中位无进展生存期74天，14例患者ctDNA得到清除，50%直至文章发表时仍未发生复发，且中位无进展生存期567天，ctDNA清除的患者预后显著优于ctDNA未清除患者。从本研究可以看出，ctDNA检测在局部晚期NSCLC患者复发预测中具有一定的应用价值，但是由于样本量以及检测范围的局限性，需要更大型、前瞻性研究进一步验证。
既往类似研究也表明无论是否接受巩固免疫治疗，ctDNA清除的LA-NSCLC患者接受CRT后的生存期均优于未清除患者，同时还发现ctDNA未清除患者接受免疫巩固治疗后预后均优于未接受的患者，提示ctDNA可作为免疫巩固治疗的预测生物标记物。但ctDNA对于免疫巩固治疗的预测作用未在该研究中未得到证实，因为本研究中只有3例ctDNA未清除，样本量较少，并且只检测了36个基因，未检测肿瘤组织，无法排除克隆性造血，这些因素可能导致该检测敏感度降低出现假阴性。
依据现有结果，利用NGS大Panel，进行以组织突变信息为基础的的ctDNA动态监测更具临床实践应用价值，我们期待未来有更多的研究证实ctDNA在预测复发、免疫巩固治疗等方面的应用价值，为患者带来更多的获益，为精准治疗提供更多的证据。
摘要
循环肿瘤 DNA（ctDNA）检测可筛选局部晚期非小细胞肺癌（LA-NSCLC）同步放化疗（CRT）后的高危复发患者。本研究评估了ctDNA动态监测用于LA-NSCLC预后预测的可行性。通过动态收集43例患者CRT前（pre-CRT）、CRT后（post-CRT1）及CRT后每季度随访一次直至随访满12月，及疾病进展时的血浆样本进行ctDNA检测与分析，发现大部分患者为ⅢB期，排除掉非癌症相关死亡，3例ctDNA未清除患者均出现复发，50% ctDNA清除患者未出现复发，且中位PFS较ctDNA未清除患者显著延长（ 567 vs 74 天, p = 0.01）。因此，ctDNA动态监测在鉴别CRT后复发高危LA-NSCLC患者中具有一定可行性和应用价值。
研究背景
非小细胞肺癌（NSCLC）约占新诊断肺癌的85%。其中约27%的 NSCLC 患者诊断为局部晚期（LA-NSCLC），需要进行同步放化疗（CRT）。但相当比例局部晚期患者经标准CRT及免疫治疗后仍出现复发甚至远处转移。且部分患者单纯CRT即可达到治愈，无需度伐利尤单抗巩固治疗，后者3级及以上不良事件发生率高达30.5%。因此，需要预后分子标志物帮助筛选可从免疫巩固治疗获益的人群。
肿瘤细胞可释放ctDNA入血，可通过血液样本检测与肿瘤进展及耐药相关的突变。既往有研究报道ctDNA可提示早期及LA-NSCLC患者预后。ctDNA有潜力用于鉴别LA-NSCLC经CRT治疗后的高危复发患者并预测从巩固治疗中获益的患者。本文通过基于商业化NGS 小Panel的ctDNA检测，探讨ctDNA在LA-NSCLC预后预测中的作用，基于既往研究结果，假设CRT后ctDNA无法达到清除的患者预后较差。
研究方法
研究纳入II-III期不适合手术的NSCLC患者，打算接受同步放化疗（CRT）的患者，同时也纳入诱导或巩固化疗后进行巩固免疫治疗的患者。血浆ctDNA收集时间节点分别为CRT开始2周前（pre-CRT）、CRT完成后（post-CRT1）、CRT完成后每三月随访直至满12月（post-CRT 2、3、4、5）及肿瘤进展时（图1）。ctDNA分析包括肺癌36个常见肿瘤相关基因的单核苷酸变异、插入、缺失及拷贝数改变。ctDNA清除定义为pre-CRT的非胚系突变在post-CRT1中未检出。胚系突变定义为所有时间节点检测的等位基因频率（AF）＞40%的突变。
图1. 研究流程图
研究结果
研究纳入2017年9月至2019年10月就诊于古斯塔夫·鲁西研究所及华盛顿大学医学院的43例患者。其中28/43例（65%）患者在pre-CRT ctDNA中检测到基因变异，19/43例（44%）患者在post-CRT1 ctDNA中检测到基因变异，并被纳入最终分析（图2、表1）。此队列患者中位年龄为65岁，IIIB期患者比例为53%，84%患者存在吸烟史。9例（47%）鳞癌患者，7例（37%）腺癌患者，3例（16%）未分化癌或其他病理类型患者。所有患者均接受卡铂联合紫杉醇周疗。10例（53%）患者未接受免疫巩固治疗，8例（42%）患者度伐利尤单抗或阿替利珠单抗治疗。
图2. 患者筛选流程
表1. 患者基线特征
pre-CRT样本中，每个样本平均检出2个突变，中位AF为0.53%。所有突变均为非同义突变。最常见突变为TP53（17/19，89%）、PIK3CA（5/19，26%）、CDKN2A（4/19，21%）、EGFR（3/19，16%）（图3）。
图3. pre-CRT时患者的突变分布状态
2例患者在采集post-CRT2前因非肿瘤原因死亡（心肌梗塞、ARDS），未纳入进一步分析。post-CRT1时，3例患者ctDNA未清除，其中位至疾病进展时间为74天。14例患者ctDNA得到清除，中位随访时间为469天，其中7例患者至数据截止时仍未复发，7例患者后续随访过程中疾病复发，中位至疾病进展时间为217天。ctDNA达到清除与未达到清除患者的中位PFS分别为567天和74天（图4）。
图4. ctDNA清除状态及疾病进展情况
14例ctDNA清除的患者中，1例巩固治疗情况未知，6例患者接受免疫巩固治疗，其中2例患者后续疾病进展；7例患者未接受免疫巩固治疗，5例疾病进展。14例post-CRT1 ctDNA清除患者的pre-CRT中位AF为0.71%，其中后续疾病进展的7例患者pre-CRT中位AF为2.11%，其余未发生疾病进展的7例患者pre-CRT中位AF为0.52%。但进展/未进展患者间pre-CRT无统计学差异（图5）。
图5. ctDNA清除患者pre-CRT时的中位/最大AF
8例患者出现新发（非pre-CRT）突变，中位AF为0.32%，其中6例患者疾病进展。7例ctDNA清除但后续疾病进展的患者中，3例存在新发突变，中位AF为0.07%。3例ctDNA未达到清除患者均在post-CRT1或之后出现新发突变，包括pre-CRT突变患者在内的中位AF为3.66%。
讨论
本研究首次证实基于商业化的NGS小Panel ctDNA检测在LA-NSCLC复发预测中的应用价值，发现CRT治疗后残存ctDNA的患者与较差的预后相关。本研究中ctDNA未清除的患者均出现疾病进展，至疾病进展时间较ctDNA清除患者显著缩短。50% ctDNA清除患者在文章发表时仍未进展。
既往包含肺癌在内的多个癌种的众多研究均证实术后或CRT后ctDNA清除与较好的预后显著相关，但这些基因Panel均需先进行肿瘤组织测序。Moding等人利用个性化的NGS Panel的研究证明，无论是否接受巩固免疫治疗，ctDNA清除的LA-NSCLC患者接受CRT后的生存期均优于未清除患者。而ctDNA未清除患者接受免疫治疗后预后均优于未接受免疫治疗患者。因此，ctDNA可作为LA-NSCLC患者的预测生物标记物。
既往研究多采用定制化基因Ppanel，而本研究是利用商业化固定基因Panel检测，临床中较易实施，价格适中。但不足之处在于有限的基因检测范围，无法检出不在检测范围内的突变，因此可能存在pre-CRT时这些突变即存在，但由于检测范围小而表现为假阴性，敏感性降低。并且缺乏来自肿瘤组织或血液白细胞的测序数据，很难鉴别ctDNA的来源，无法很好地排除克隆性造血。同时，有些基因变异可能存在，但是因为低于检测下限而无法检出，被部分患者可能被误分类至ctDNA清除患者中但忽略这些因素，本研究发现最常见突变与既往活检肺癌突变谱相同，分别为TP53、PIK3CA、CDKN2A、KRAS及EGFR。且8例（47%）患者后续检出新发突变，6例（75%）随访过程中出现复发。利用ctDNA可以鉴别CRT后的高复发风险个体，这类患者预后差，但仍需前瞻性的研究进行进一步验证。
