本研究旨在探索MSI-H/dMMR胃肠肿瘤患者应用免疫治疗的疗效预测标志物。患者接受二代测序检测基因突变情况，并通过转录组学分析及多重荧光免疫组化评估肿瘤微环境，发现所有TMB-L的患者接受免疫治疗后均未获得CR或PR。与TMB-H肿瘤相比，TMB-L肿瘤接受免疫治疗后PFS和OS显著缩短。PTEN突变患者ORR明显低于野生型患者。PTEN磷酸酶结构域突变患者接受免疫治疗后PFS和OS更差，PTEN突变的肿瘤免疫微环境中CD8+ T细胞水平显著减低，瘤内CD204+ 巨噬细胞水平显著升高并出现PI3K/AKT/mTOR通路富集等现象。该研究证实TMB-L及PTEN突变（尤其磷酸酶结构域突变伴肿瘤微环境改变）可能是MSI-H/dMMR胃肠肿瘤患者从免疫治疗显著获益的概率较低。
研究背景
MSI-H/dMMR肿瘤通常存在多种基因突变，导致新生抗原表达增加、CD8+ T细胞浸润增加、肿瘤微环境中相关免疫检查点分子表达发生变化。免疫检查点抑制剂如PD-1抑制剂可提高MSI-H/dMMR胃肠道肿瘤患者的生存，多项大型临床研究结果表明PD-1抑制剂疗效明显优于化疗，但这些接受免疫治疗的MSI-H/dMMR患者中约50%会出现早期疾病进展，因此，确定PD-1抑制剂疗效预测的阴性标记物迫在眉睫，也可为对免疫治疗耐药患者的联合治疗提供依据。 研究方法 研究纳入2015年7月至2020年6月日本千叶东国立癌症中心医院接收的MSI-H/dMMR并接受PD-1抑制剂治疗的局部进展/转移性GI肿瘤患者。纳入标准包括：ECOG PS 0-1分；接受PD-1抑制剂单药或联合治疗等。进行MSI分析及MMR状态评估。MLH1、MSH2、PMS2或MSH6任一蛋白表达缺失即定义为dMMR。MSI的状态通过PCR法进行检测，如果其中有两个或两个以上检测位点是不稳定的，就定义为MSI-H。对既往病理组织进行基因分析，包括WES及NGS方法。利用RNA测序和IHC分析肿瘤免疫微环境。主要疗效研究终点为ORR、DCR、PFS及OS。 研究结果 入组人群 研究纳入45例患者，肿瘤类型分别为：胃癌（GC）18例、结直肠癌（CRC）17例、胆管癌5例、小肠癌2例、胰腺癌2例、十二指肠癌1例。其中有40例和33例患者分别接受二代检测。总体ORR及DCR分别为44.4%、84.4%。中位PFS为9.6月，中位OS为23.2月。研究纳入45例患者，肿瘤类型分别为：胃癌（GC）18例、结直肠癌（CRC）17例、胆管癌5例、小肠癌2例、胰腺癌2例、十二指肠癌1例。其中有40例和33例患者分别接受二代检测。总体ORR及DCR分别为44.4%、84.4%。中位PFS为9.6月，中位OS为23.2月。 图1. 肿瘤大小变化瀑布图 与PD-1抑制剂疗效相关的分子特征 40例接受WES检测患者的中位TMB为38.7 muts/Mb。45例MSI-H/dMMR患者中，36例为TMB-H（≥10 muts/Mb），其余均为TMB-L（＜10 muts/Mb）（图2）。只进行NGS检测的5例患者均为TMB-H。TMB-L患者均对免疫治疗无应答，且PFS及OS均劣于TMB-H患者（图3A、图3B）。多变量分析显示TMB-L为PFS及OS的预后不良因素。 图2. PD-1抑制剂治疗MSI-H/dMMR GI肿瘤的综合分子特征 相反，存在FGFR2、TCF7、NOTCH1或POLE突变的患者ORR高于无这些基因突变的患者（表2）。其中，存在NOTCH1或POLE突变的肿瘤TMB明显升高(中位TMB: NOTCH1,46.1 muts/Mb [range, 8.5 to 93.0] vs 29.5 muts/Mb [range, 3.6 to 59.7], P = 0.004; POLE, 50.6 muts/Mb [range, 20.3 to 83.6] vs 37.5 muts/Mb [range, 3.6 to 93.0], P = 0.021, respectively).。而PD-L1表达不同对ORR并无影响。 在34例携带常见基因改变的GI患者中，仅PTEN突变患者较野生型患者ORR显著降低（21.4% vs 54.8%，P=0.045）（图2），但其TMB水平较野生型明显升高(中位TMB [range]; 43.2 [29.9 to 93.0] muts/Mb vs 20.3 [3.6 to 83.6] muts/Mb,P = 0.017)。PTEN突变及TMB-L呈互斥状态。PTEN突变患者的PFS及OS均较野生型患者缩短，但并无统计学差异。 进一步探索发现，PTEN突变发生于磷酸酶结构域的患者的ORR、PFS及OS均劣于PTEN野生型患者（图3C、图3D）。相反， PTENC2结构域突变的患者疗效与野生型患者并无差异（图3C、图3D）。多变量分析显示PTEN磷酸酶结构域突变是PFS及OS的阴性独立预后因素。接受PD-1抑制剂治疗6个月内出现疾病进展的20例患者中，4例（20%）为TMB-L肿瘤，8例（40%）为PTEN磷酸酶结构域突变。 图3. A：不同TMB水平肿瘤的PFS；B：不同TMB水平肿瘤的OS；C：PTEN不同结构域突变肿瘤的PFS；D：PTEN不同结构域突变肿瘤的OS 不同PTEN突变状态对肿瘤微环境的影响 与PTEN基因野生型肿瘤相比，PTEN磷酸酶结构域突变肿瘤的瘤内CD8+ T细胞水平显著减低，瘤内CD204+ 巨噬细胞水平显著增加（图4）。PTEN磷酸酶结构域突变可抑制肿瘤微环境、使肿瘤相关巨噬细胞浸润增加，从而抑制免疫微环境，并影响PTEN蛋白的表达。PTEN是PI3K/AKT/mTOR的负向调控因子，转录组数据分析提示，与PTEN野生型肿瘤相比，PTEN磷酸酶结构域突变肿瘤的mRNA表达显著降低。 图4. A：根据不同PTEN突变状态进行多重荧光IHC分析 讨论 本研究队列中，接受PD-1抑制剂治疗的TMB-L肿瘤疗效较差，与既往关于MSI-H/dMMR CRC的研究结果一致。KEYNOTE-158研究证实，与TMB-L肿瘤相比，TMB-H肿瘤经帕博利珠单抗治疗后 ORR更高[30.3% (27.1% in MSS) vs 6.7%]，提示TMB可能是MSS/pMMR肿瘤接受免疫治疗的有效疗效预测标志物。本研究表明TMB可能是MSI-H/dMMR肿瘤免疫治疗疗效预测标志物，但最佳cutoff值仍需进一步研究探索。 本研究探索众多驱动基因突变，仅PTEN突变与免疫治疗ORR降低显著相关，并与TMB-L互斥。PTEN磷酸酶结构域突变肿瘤的ORR、PFS及OS均较野生型显著下降，且抑制肿瘤微环境，但C2结构域突变者则无此差异。因此，免疫治疗的疗效取决于PTEN突变的结构域。PTEN磷酸酶结构域突变与PTEN mRNA表达降低和PTEN蛋白缺失显著相关，常致PI3K/AKT/mTOR及MTORC1信号通路富集。这些发现提示PTEN磷酸酶结构域突变与PTEN功能缺失相关，导致对免疫治疗的耐药。 本研究亦证实存在NOTCH1或POLE突变的MSI-H/dMMR GI肿瘤TMB水平较野生型患者显著升高，接受免疫治疗后ORR也显著提高。 本研究局限在于样本量较小，且为回顾性单中心研究。由于原发部位不同，可能导致肿瘤具有一定异质性。 点评 本研究为第一项全面探索影响MSI-H/dMMR 肿瘤患者接受PD-1抑制剂治疗疗效的肿瘤分子特征的研究。PD-1 抑制剂帕博利珠单抗已获得中国国家药品监督管理局（NMPA）批准单药用于 KRAS、NRAS 和 BRAF 基因均为野生型，不可切除或转移性MSI-H/dMMR结直肠癌患者的一线治疗。尤其需要注意的是KEYNOTE177研究中，相当部分患者接受免疫治疗后的疾病控制率显著差于化疗，只有在4个月后疾病仍未进展的患者，才可以显著获益于免疫治疗，提示MSI-H/dMMR 接受免疫治疗仍需精准的标志物进行分层，才可以不留遗憾。 本研究发现，TMB-L及PTEN磷酸酶结构域突变的MSI-H/dMMR GI肿瘤从PD-1抑制剂治疗中获益概率较低。对于携带PTEN突变的MSI-H/dMMR肿瘤，免疫治疗耐药后，应用靶向免疫抑制细胞的酪氨酸激酶，如VEGFR抑制剂或仍有获益几率。 精准治疗时代，免疫治疗也要精准，而且必须要更精准。得益于独创的MSI-sensor系列算法，求臻医学已形成了肿瘤样本检测多层次应用场景的NGS-MSI算法体系。当前，ChosenOne599®已全面涵盖MSI、TMB、HLA及众多免疫治疗相关正负向因子。无论是对于本研究提及的MSI-H/dMMR患者还是泛癌种的免疫治疗，ChosenOne599®均可展现出患者最全面的分子特征，对免疫治疗进行精准综合的评估，精准分层，使患者更加精准、科学、合理地使用免疫治疗药物。 参考文献：A low tumor mutational burden and PTEN mutations are predictors of a negative response to PD-1 blockade in MSI-H/dMMR gastrointestinal tumors. Clin Cancer Res. 2021 Apr 29.
